۱- مقدمه و تاریخچه کروماتوگرافی

روش‌های کروماتوگرافی بر پایه دو مفهوم کلی دسته‌بندی می‌شوند: در روش اول، جداسازی بر اساس مفاهیم فیزیکی صورت گرفته و شامل دو گروه کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است.

اساس نام‌گذاری در دسته‌بندی دوم که مرسوم‌‌تر است، نوع فاز متحرک، فاز ساکن و همچنین نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است. این دسته شامل دو گروه کلی کروماتوگرافی مایع (فاز متحرک، مایع می‌باشد) و کروماتوگرافی گازی (با فاز متحرک گاز) است.

۲- مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی

درتمامی روش‌های کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام می‌شود. این تفاوت مقدار، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی می‌گردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان می‌کنند. در این رابطه C_m و C_s به ترتیب نشان‌دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.

نتایج تحقیقات نشان می‌دهند که پدیده‌های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی بر روی سرعت جداسازی و همچنین پهنای باند دیده شده برای هر آنالیت تاثیر دارند. از بین تئوری‌های موجود که به توجیه و محاسبه این عوامل می‌پردازند، تئوری بشقابک‌های فرضی (Plates) کاربرد بیشتری دارد. در این تئوری فرض می‌شود که هرستون از یک سری لایه‌های باریک، افقی و کاملا مجزا از هم، که به طور متوالی قرار گرفته‌اند، تشکیل شده است. به هر یک از این لایه‌ها، بشقابک گفته می‌شود. در هر کدام از این بشقابک‌ها، آنالیت در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد و در نهایت با انتقال بین بشقابک‌ها عمل جداسازی صورت می‌پذیرد. کارایی هر ستون به تعداد بشقابک‌های موجود درستون و یا به عبارت دیگر، به تعداد تعادل‌های ایجاد شده در ستون بستگی دارد. بنابراین برای بررسی کارایی ستون، تعداد بشقابک‌های فرض (N) را از رابطه زیرمحاسبه می‌کنند. در این رابطه H نشان‌دهنده ارتفاع هر بشقابک و L طول ستون را به نمایش می‌گذارد.

در این مباحث پارامترها و تعاریف مختلف دیگری به منظور محاسبه کارایی، شرایط آزمایشگاهی و در نهایت اندازه‌گیری کمی آنالیت وجود دارند. برای اطلاعات بیشتر به منبع شماره ۱ مراجعه شود.

۳- کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا 

از میان تکنیک‌های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیون‌ها دلار صرف خرید و فروش دستگاه‌های HPLC در دنیا می‌شود. علت این رشد را می‌توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه‌های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیک GC (کروماتوگرافی گازی) امکان‌پذیر نیستند، نسبت داد.

۳-۱- فاز ساکن و فاز متحرک 

در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌‌شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:

هیدروکربن < اترها < استرها < کتون‌ها < آلدئیدها < آمیدها < آمین‌ها < الکل‌ها

خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:

• درصد خلوص بالا (حلال‌هایی با درصد خلوص بسیار بالا، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد)

• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون (به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می‌شود)

• واکنش‌پذیری کم (Inertness)
• قابلیت تطابق با آشکارساز

۳-۲- اجزاء و قسمت‌های مختلف دستگاه HPLC

دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت‌های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود:

۱- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌های شستشودهنده ستون ریخته شده است.

۲- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می‌گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیت‌ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیک‌ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می‌شود که در ستون‌هایی با قطر مرسوم (کمتر از ۵mm)، سرعت جریان نباید بالاتر از ۲/۵ ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می‌شود.

به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال‌ها در ازای یک حلال خالص می‌تواند به‌کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می‌شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته می‌شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه‌ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می‌یابد.

۳- تزریق‌کننده (Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ‌هایی با ظرفیت‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه‌بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد ۵ تا ۵۰۰ میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.

۴- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column) می‌شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی‌متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده‌ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمی‌کند. طول ستون‌های اصلی دستگاه معمولا حدود ۳۰-۱۰ سانتی‌متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته‌دار و یا متخلخل است، پر کرده‌اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد ۳ تا ۵ میکرومتر است.

ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم‌ترین ستون‌های غیرقطبی می‌توان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector) هدایت می‌شوند.

در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می‌کنیم. برای مثال در ستون‌های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو می‌دهند.

۵- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:

> حساسیت بالا
> غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی، نمونه را تخریب نکند.
> پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)

درادامه به تعدادی ازآشکارسازهای مرسوم اشاره می‌شود:

الف- از پرکاربردترین انواع آشکارساز، طیف‌سنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت نمونه اندازه‌‌گیری می‌شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می‌شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می‌بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم‌های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.

ب- آشکارساز ضریب شکست: اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می‌شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت ازآن استفاده می‌شود.

ج- آشکارساز فلورسانس، حساس‌تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند؛ درنتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.

د- آشکارساز الکتروشیمیایی، که عملکرد آن برپایه واکنش‌های اکسید و احیا می‌باشد و شامل روش‌های آمپرومتری (Amperometry)، پلاروگرافی (Polarography)، کلون‌سنجی (Coulometry) و هدایت‌سنجی (Conductometry) است.

ه- آشکارساز طیف‌سنج جرمی (MS): این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می‌گیرد. از این جمله می‌توان به حد تشخیص (LOD) بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری (Selectivity) بالا، و امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم‌های شیمیایی اشاره کرد.

در صورتیکه از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق‌سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می‌شود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است.

۴- اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام

یک نمونه کروماتوگرام در شکل ۲ نشان داده شده است که در آن سه نوع قند از یکدیگر جدا شده‌اند. اطلاعات کمی، نیمه کمی و کیفی از ولتاموگرام قابل استخراج است.

شکل ۲- نمونه‌ای از یک کروماتوگرام

۴-۱- کاربردهای کیفی:

آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می‌شود. از آنجایی‌که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص می‌باشد، می‌توان از آن جهت تعیین نوع آنالیت استفاده کرد. به این منظور کروماتوگرام آنالیت را با کروماتوگرام به‌دست آمده از استاندارد آن آنالیت مقایسه می‌کنند. در صورت یکسان بودن زمان بازداری می‌توان با قطعیت نوع ماده را تعیین کرد. ذکر این نکته لازم است که این مقایسه این دو کروماتوگرام تنها در شرایط آزمایشگاهی و دستگاهی کاملاً یکسان معتبر است.

۴-۲- آنالیز کمی:

به‌منظور تعیین کمی مقدار آنالیت، سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول را با نمونه استاندارد مقایسه می‌کنند. در مواردی که پیک‌ها باریک و متقارن باشند، اندازه‌گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است. هر چند که امروزه به‌راحتی می‌توان ارتفاع و سطح زیر پیک را به کمک دستگاه‌های الکترونیک با دقت و صحت بالایی محاسبه کرد. روش‌های مختلفی جهت محاسبه مقدار مجهول وجود دارد که در ادامه به برخی از این روش‌ها اشاره می‌شود:

۴-۲-۱- روش استاندارد خارجی (External Standard): 

در این روش، محلول‌هایی با غلظت‌های مختلف از استاندارد (استاندارد آنالیت مورد نظر) ساخته شده و سپس بر اساس ارتفاع یا سطح زیر پیک بدست آمده از کروماتوگرام این استانداردها، منحنی کالیبراسیون (منحنی ارتفاع و یا سطح زیر پیک، بر حسب غلظت) رسم می‌شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده، مقدار ارتفاع و یا سطح زیر پیک نمونه مجهول، مقدار دقیق آنالیت محاسبه می‌شود.

۴-۲-۲- روش افزایش استاندارد (Standard Addition): 

در این روش ابتدا ماده مجهول، آنالیز می‌شود، سپس به چند ظرف که حاوی مقدار یکسانی از نمونه است، حجم‌های مشخصی از استاندارد اضافه می‌شود و کروماتوگرام مربوط به هر مرحله را آنالیز و در نهایت ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه‌ها را بر اساس حجم استاندارد اضافه شده رسم می‌کنند. در نهایت با استفاده از روابط موجود می‌توان غلظت نمونه را محاسبه کرد. استفاده از این روش سبب حفظ بافت و ماتریس نمونه‌ها می‌شود، در نتیجه با این روش احتمال مزاحمت بافت (Matrix Interference) نمونه از بین برده می‌شود.

۴-۲-۳- استاندارد داخلی (Internal Standard): 

دو نوع خطا (سیستماتیک و تصادفی) در سیستم موجود است. برخی از این منابع ثابت را می‌توان با اضافه کردن یک استاندارد داخلی به نمونه‌ها و تقسیم ارتفاع پیک یا سطح زیر پیک مربوط به هر آنالیت بر همین مقادیر مربوط به استاندارد داخلی، حذف کرد. در انتخاب استاندارد داخلی باید به شباهت‌های ساختاری آنالیت با جزء انتخابی، نزدیک بودن زمان بازداری پیک آن به پیک نمونه و …، توجه کرد. با انتخاب یک استاندارد داخلی مناسب می‌توان خطا را از ۱ تا ۲ درصد به ۵٫۰ تا ۱ درصد کاهش داد.

نتیجه گیری

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه‌گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روش‌های دیگر و آشکارسازهای پیشرفته‌ای مانند طیف‌‍سنج جرمی کاربردهای زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.

دستگاه طیف سنج جذب اتمی و پلاسمای جفت القائی ICP از تجهیزاتی هستند که برای آنالیز تعداد زیادی از عناصر به کار می روند. این دو تکنیک از جنبه های مختلف تفاوت های بسیاری با یکدیگر دارند. به طور کلی تفاوت در عملکرد دو دستگاه جذب اتمی و دستگاه ICP را می توان از نظر مکانیسم، سرعت، حداکثر دما، حد تشخیص، تداخل شیمیایی و قیمت مورد بررسی قرار داد. هر کدام از این تفاوت ها می تواند استفاده از دستگاه ها را با مزیت ها و محدودیت های مواجه کند. بنابراین، بررسی دقیق امکانات و محدودیت های موجود در هر دستگاه جذب اتمی و دستگاه ICP یکی از مهم ترین معیارهای انتخاب می باشد.

مقایسه مکانیسم و دما در جذب اتمی و ICP
اصلی ترین تفاوت دو تکنیک اسپکتروسکوپی از لحاظ مکانیسم این است که یکی بر پایه جذب اتمی و دیگری بر پایه نشر اتمی یا یونی متکی است. مورد دیگر، تفاوت در روش تولید یون و یا اتم می باشد. به گونه ای که در جذب اتمی از شعله احتراق یا کوره گرافیتی برای تولید اتم و در دستگاه ICP ازحالت پلاسما برای تولید اتم و یا یون استفاده می شود.

حداکثر دما در جذب اتمی برای هوا-استیلن ۲۳۰۰ و برای نیترواکساید−استیلن ۲۹۰۰ درجه سانتیگراد می باشد. در حالی که این دما در حالت پلاسمای آرگون دستگاه آی سی پی به ۱۰۰۰۰ درجه سانتیگراد می رسد.

مقایسه حد تشخیص دستگاه جذب اتمی و ICP
در صورتی که عنصری قابلیت اتمایز شدن داشته باشد قدرت تشخیص برای جذب اتمی در حالت کوره در تمام موارد بیشتر از دستگاه طیف سنج ICP است.
حد تشخیص برای تعدادی از عناصر مانند پتاسیم و سدیم در حالت شعله دستگاه جذب اتمی بسیار بهتر از طیف سنج ICP می باشد.
دقت تشخیص برای عناصر مقاوم در برابر حرارت مانند وانادیم، بور، تیتانیم و آلومینیم در دستگاه ICP بسیار بیشتر از شعله جذب اتمی می باشد.
مواد غیر فلزی مانند سولفور، نیتروژن، کربن و هالوژن (مانند ید، کلر و برم) تنها با استفاده از دستگاه ICP قابل تشخیص می باشند.
هر چند تشخیص فسفر توسط طیف سنج جذب اتمی امکانپذیر است، اما دقت تشخیص آن برای دستگاه ICP بسیار بیشتر می باشد.
اندازه گیری مقدار بهینه عناصرغیر فلزی مانند گوگرد، نیتروژن و هالوژن ها توسط دستگاه ICP تنها در حالت خلاء امکانپذیر است. با این کار اکسیژن را از محیط خارج کرده و مانع جذب توسط آن می شود.
توجه داشته باشید که برای بهبود حد تشخیص عناصری مانند Se ،As ،Hg ،Sb ،Bi و Ge هم در جذب اتمی و هم دستگاه ICP-ES می توان از سیستم تولید بخار یا HVG استفاده کرد.

مقایسه حد تشخیص جذب اتمی و دستگاه ICP
مقایسه حد تشخیص دستگاه جذب اتمی و دستگاه ICP

مقایسه جذب اتمی و ICP از نظر سرعت
در صورتی که تنها یک عنصر در نمونه مورد آنالیز باشد دستگاه جذب اتمی عملکرد سریعتری نسبت به ICP دارد. اما در آنالیز چندین عنصر از آنجا که دستگاه ICP توانایی آنالیز همزمان دارد، زمان آنالیز در ازای هر نمونه بسیار کمتر از زمان لازم در دستگاه اتمیک است.

از انجا که دستگاه اتمیک ابزوربشن قادر به اندازه گیری همزمان عناصر نمی باشد، آنالیز هر عنصر باید به صورت جداگانه صورت گیرد که باعث پایین آمدن سرعت می شود. برای رفع این مشکل می توان از سیستم اتوماتیک و اتوسمپلر به جای سیستم دستی استفاده کرد. اگر چه با استفاده از این روش همچنان نمونه باید چندین بار مورد آنالیز قرار گیرد، اما زمان صرف شده در ازای هر نمونه به مقدار قابل توجه نسبت به روش دستی کاهش می یابد. علاوه بر این باعث افزایش دقت آنالیز و کمتر شدن وظایف اپراتور نیز می شود.

مقایسه سرعت و حد تشخیص دستگاه جذب اتمی و ICP
مقایسه دستگاه های جذب اتمی و طیف سنج ICP از نظر سرعت و حد تشخیص

تداخل شیمیایی در جذب اتمی و دستگاه ICP
تداخل شیمیایی در دستگاه جذب اتمی بخصوص در کوره گرافیتی امری رایج می باشد که با اصلاحات شیمیایی قابل تصحیح می باشد. اما دستگاه ICP-ES تقریبا بدون هر گونه تداخل شیمیایی است. زیرا تداخلات شیمیایی که تا ۳۰۰۰ درجه سانتیگراد وجود دارد در دمای بالای ۶۰۰۰ درجه و درحالت پلاسما به طور کامل از بین می روند.

مقایسه قیمت جذب اتمی و ICP
از جمله بزرگترین محدودیت های استفاده از دستگاه ICP قیمت بالای آن می باشد. این امر موجب می گردد توجه آزمایشگاه ها معمولاً به سمت استفاده از دستگاه طیف سنج جذب اتمی (AAS) معطوف شود. در واقع دستگاه طیف سنج Atomic Absorption جایگزینی است که در عین دقت مناسب از لحاظ قیمت نیز مقرون به صرفه و گزینه ای ایده آل به منظور آنالیز عناصر می باشد.