دستگاه الایزا ریدر یا میکروپلیت ریدر
دستگاه میکروپلیت ریدر (Microplate – Reader ) معمولاً به نام های میکروفتومتریک – پلیت ریدر ، دستگاه الایزا ریدر و خوانش گر الایزا نیز نامیده می شود . یک اسپکتروفتومتر تخصصی بوده که به منظور قرائت نتایج فتومتریک آزمایش الایزا طراحی شده است . از تکنیک الیزا به منظور تعیین حضور آنتی بادی ها یا آنتی ژن های اختصاصی در نمونه ها استفاده می شود. این تکنیک براساس تشخیص یک آنتی ژن یا آنتی بادی روی یک سطح جامد به صورت مستقیم یا ثانویه ، به کمک آنتی بادی های نشاندار و ایجاد شدن محصولاتی استوار است که می توان آنها را توسط اسپکتروفتومتر خواند. واژه الایزا(ELISA) اختصاری از کلمات(Enzyme-Linked Sorbent Assay) است.
کاربرد دستگاه میکروپلیت ریدر
دستگاه میکروپلیت ریدر برای خواندن نتایج تست های الایزا مورد استفاده قرار می گیرد . این تکنیک کاربردی مستقیم در ایمنولوژی و سرولوژی دارد. از میان کاربردهای این وسیله می توان به تایید حضور آنتی بادی ها یا آنتی ژن های یک عامل عفونی ، اثبات وجود آنتی بادی های اختصاصی یک واکسن و یا اتو آنتی بادی ها در نمونه اشاره کرد.
اصول کار
دستگاه الایزا ریدر یا همان دستگاه میکروپلیت ریدر یک اسپکتروفتومتر اختصاصی است . بر خلاف اسپکتروفتومترهای معمولی که قرائت جذب نوری را در گستره وسیعی از طول موج ها انجام می دهد،دستگاه الایزا ریدر دارای فیلترها یا گریتینگ های انکساری بوده و تنها قادر است جذب نوری را در گستره طول موج های محدوده ۳۴۰ یا ۷۰۰ نانومتر اندازه گیری نماید. سیستم نوری دستگاه الایزا ریدر توسط تعدادی از کارخانه ها با استفاده از فیبرهای نوری و به منظور تامین نور جهت چاهک های حاوی نمونه در میکروپلیت طراحی شده است . ابتدا یک شعاع نوری از چاهکی که دارای قطری بین ۱ تا ۳ میلی متر است عبور کرده و سپس یک سیستم آشکار ساز ، نور عبوری از نمونه را تقویت می کند .در مرحله بعد از دستگاه الایزا ریدر سیگنال مربوط به جذب نوری نمونه ها ثبت شده و سیستم خوانشگر نیز آن را به اطلاعاتی تبدیل می کند که سبب تفسیر نتایج آزمایش می شوند. برخی از دستگاه الایزا ریدر ها (دستگاه میکروپلیت ریدر) با استفاده از سیستم های شعاعی نوری دوتایی کار می کنند.
استانداردها ، کنترل ها و نمونه های مورد آزمایش در پلیت هایی که برای این منظور طراحی شده و دارای تعداد خاصی چاهک هستند ریخته می شوند. پلیت های ۸ ستونی همراه با ۱۲ ردیف که در مجموع ۹۶ چاهک را تشکیل می دهند رایج تر از بقیه هستند . برای کاربردهای اختصاصی تر دستگاه الایزا ریدر، تعداد چاهک های پلیت افزایش می یابد که در برخی موارد تا ۳۸۴ چاهک را نیز شامل می شود. افزایش تعداد چاهک ها به منظور کاهش مقدار مصرف معرف ها جهت استانداردها و کنترل است. موقعیت سنسور نوری دستگاه الایزا ریدر براساس نوع کارخانه سازنده متغیر است ، به طوری که در برخی موارد ممکن است در بالای پلیت حاوی نمونه و گاهی نیز مستقیماً در زیر پلیت قرارگیرد. امروزه دستگاه میکروپلیت ریدر ها دارای کنترل هایی هستند که بوسیله میکروپروسسورها تنظیم شده اند.
وسایل لازم جهت انجام تکنیک الایزا
جهت انجام آزمایش الایزا تجهیزات زیر مورد نیاز است :
۱)دستگاه الایزا ریدر (دستگاه میکروپلیت ریدر)
۲) میکروپلیت واشر ( شستشو دهنده چاهک ها )
۳) سیستم توزیع کننده مایع که در این مورد ممکن است از پیپت های چند کاناله استفاده شود
۴) انکوباتور
مراحل مکانیکی انجام تکنیک الایزا
یک تست الایزا به طور رایج شامل مراحل زیر است:
۱) شستشوی پلیت که می تواند با استفاده از میکروپلیت واشر انجام شود.
۲) استفاده از یک توزیع کننده مایعات (دیسپنسر) یا پیپت چند کاناله
۳) پلیت در انکوباتوری قرار داده می شود که دارای دمای کنترل شده بوده و واکنش ها در آن انجام می شوند.
بسته به نوع آزمایش ، مراحل ۱،۲ و ۳ ممکن است چندین بار تکرار شوند تا آن که معرف های اضافه شده واکنش ها را کامل کنند.
سرانجام ، وقتی تمام مراحل انکوباسیون کامل شد، پلیت به دستگاه الایزا ریدر ( دستگاه میکروپلیت ریدر ) منتقل شده و سپس با قرائت جذب نوری نمونه ها نتیجه آنها مشخص می شود.
مراحل بیوشیمیایی تکنیک الایزا
چاهک های موجود در پلیت با آنتی بادی ها و یا آنتی ژن های اختصاصی کد شده اند. نمونه ها، کنترل ها و استانداردها به چاهک ها اضافه شده و در دمای اتاق یا ۳۷ درجه سانتی گراد برای مدت زمان معینی و طبق دستورالعمل آزمایش انکوبه می شوند. در طول انکوباسیون ، بسته به حضور یا عدم حضور و مقدار آنتی ژن یا آنتی بادی موجود در نمونه ، آنتی ژن نمونه به آنتی بادی کد شده در سطح چاهک متصل شده و یا آنتی بادی موجود در نمونه به آنتی ژن موجود در سطح چاهک باند می شود.
پس از انکوباسیون ، با استفاده از دستگاه میکروپلیت واشر و یک بافر شستشو دهنده آنتی ژن ها یا آنتی بادی های آزاد ، شستشو داده شده برداشته می شوند. در مرحله بعد یک آنتی بادی ثانویه که به علت اتصال آنزیم به کونژوگر موسوم است به محیط افزوده می شود. پس از یک دوره زمانی انکوباسیون ثانویه عمل شستشو مجدداً صورت می پذیرد تا کونژوگه اضافی از محیط خارج گردد. در مرحله بعد به منظور ایجاد شدن یک تغییر رنگ ،سوبسترای آنزیم متصل به کونژوگه به محیط اضافه گشته و مجدداً پلیت برای مدت زمان مشخصی معمولاً در تاریکی انکوبه می شود تا آنزیم بر روی سوبسترا اثر نموده و تغییر رنگ متناسب با مقدار کونژوگه در محیط شکل گیرد. در مرحله نهانی با تغییرpH محیط به وسیله محلول توقف دهنده ، واکنش آنزیم و سوبسترا قطع گشته ، از تشدید رنگ ایجاد شده جلوگیری خواهد شد. این معرف عموماً یک اسید رقیق است.
در پایان ، پلیت بوسیله دستگاه الایزا ریدر خوانده می شود. از برخی چاهک ها جهت استانداردها و کنترل ها استفاده می شود. مراحل توصیف گشته در فوق عینا برای استانداردها و کنترل ها نیز انجام می شود . از استانداردها برای رسم منحنی غلظت در مقابل جذب نوری (OD) استفاده گشته و سپس از روی آن خواه به روش دستی و خواه دستگاهی مقادیر ماده مورد نظر در نمونه ها و کنترل تعیین می گردد . در بعضی از روش ها که کیفی بوده و با مثبت و منفی گزارش می شوند از عدد Cut-off استفاده می شود.Cut-off عددی است که از روی OD استاندارد و طبق دستورالعمل کیت مصرفی محاسبه می گردد. در این دسته از روش ها تنها از یک استاندارد استفاده می شود OD بالاتر از Cut-off معمولا ًمثبت و کمتر از آن منفی گزارش خواهد شد.
