سیستم کروماتوگرافی مایع

یک سیستم کروماتوگرافی مایع برای جداسازی مخلوطی از آنالیت ها و شناسایی ترکیبات مجزا از چهار جزء اصلی تشکیل شده است. هر جزء یا ماژول در یک سیستم LC دارای یک عملکرد خاص و به همان اندازه مهم است. فرآیندهای جداسازی و شناسایی برای توضیح این ماژول ها، مسیر جریان را از ورود نمونه به دستگاه دنبال می کنیم.

ماژول گازدا–  Degasser

بسیاری از دستگاه های گروماتوگرافی دارای یک واحد گاز زدایی برای حذف هوای داخل حلال ها یا فاز متحرک هستند . وجود حباب های هوا در فاز متحرف باعث اختلال در کارکرد صحیح پمپ خواهد بود در واقع استفاده ازگاززدا برای حلال ها به کاهش نوسانات پس زمینه یا baseline آشکارساز کمک می کند .

ماژول پمپ- Pump قلب یک سیستم کروماتوگرافی مایع

قبل از تحویل فاز متحرک به سیستم، پمپ حلال ها را به نسبت ثابت مخلوط می کند. حال این اختلاط می تواند بصورت نسبت ثابت حلال ها باشد (ایزوکراتیک) یا به نسبت متفاوت ( گرادیان).

محدوده فشار پمپ

پمپ های HPLC و  UHPLC برای فرایند جداسازی، نمونه موردنظر را بهمراه فاز متحرک از طریق ستون که شامل فاز ساکن است، منتقل می کند.

پمپ باید فاز متحرک را در فشارهای بالا بین 50 تا 1300 بار تحویل دهد تا بر مقاومت فاز ساکن در ستون غلبه کند. ستون های HPLC استاندارد معمولا حاوی ذرات 5 میکرومتری مبتنی بر سیلیس هستند.

پمپ هایی که قادر به تامین جریان درفشارهای تا 400 بار هستند معمولاً برای استفاده با ستون های HPLC استاندارد بین 50 تا 300 میلی مترطول و با قطر داخلی 4.6 میلی مترکافی می باشد.

در مقابل در UHPLC مدرن ستون های بلند (مثلا 300 میلی متر) با ذرات ریز و کاملا متخلخل (کمتر از 2 میکرومترو قطرهای داخلی کوچک (کمتر از 2.1 میلی متر) به پمپ هایی نیاز دارند که بتوانند فشارهای 1000 بار یا بالاتر را تحمل کنند. نرخ جریان یا فلوی جریان Hplc  بین 100 – 10 میلی لیتر در دقیقه است.

پمپ ها در کروماتوگرافی براس نوع اختلاط حلال ها، تعداد حلال و توان فشار برگشتی به سه گروه تقسیم می شود.

• پمپ باینری- Binary
• پمپ کواتنرنری- Quaternary
• پمپ ایزوکراتیک- Isocratic

اختلاط حلال

علاوه بر تحویل فاز متحرک، پمپ باید حلال ها را با دقت بالا و نسبت مشخص شده مخلوط کند. پمپ باید یک نسبت دقیق و ثابت از حلال برای شستشوی ایزوکراتیک و همچنین گرادیان که در آن نسبت دو یا چند حلال در طول زمان تغییر می کند. توانایی مخلوط کردن حلال ها به طور دقیق و تامین فلوی جریان تکرارپذیر و بدون نوسان از ویزگی های اصلی یک پمپ خوب می باشد. زمان ماندگاری یکی از پارامترهای اساسی در کروماتوگرافی مایع و نشان دهنده مدت زمان ماندگاری جز جدا شده از ترکیب در فاز ساکن می باشد.

پمپ های کواترنری

این پمپ ها از یک پمپ تشکیل شده اند و توانایی اختلاط چهار نوع حلال را دارد. در واقع به چهار کانال برای ورود حلال به محفظه ی اختلاط حلال ها یا mixing chamber  مجهز است. حلال ها را با فشار کمتری مخلوط می کنند.

پمپ های باینری

پمپ های باینری شامل دو پمپ جداگانه می باشد و فشارهای بالاتری را میتوانند تحمل کنند و معمولاً قادرند فقط دو حلال را مخلوط کنند و مجهز به دو کانال حلال به سمت محفظه ی اختلاط حلال یا mixing chamber  می باشد.

مزیت اصلی پمپ های باینری این است که اختلاط حلال در زمان بسیار دقیق انجام میگیرد و مخلوط کردن نسبت های کوچک از یکی از حلال ها  از مزیت های بزرگ این پمپ ها می باشد. این پمپ ها اختلاط حلال بسیار دقیقی می دهد.

یکی دیگر از مزایای این نوع پمپ ها تحمل فشار برگشتی بالاتری نسبت به پمپ های کواترنری است و اختلاط حلال در پمپ باینری حجم تاخیر کمتری را دربر میگیرد.

ترموستات ستونی در کروماتوگرافی مایع HPLC – ماهیچه هایی برای تولید گرما

ترموستات ستونی یک جزء اغلب دست کم گرفته شده در یک سیستم کروماتوگرافی مایع است. این ماژول بسیار مهم است اهمیت تضمین یک محیط پایدار برای ستون جداسازی و دستیابی به نتایج قابل تکراربرای زمانیکه دمای محیط در آزمایشگاه در طول مدت تغییر می کند، محیط پایدار از اهمیت ویژه ای برخوردار است .

دما بر Retention Factor  و بر میزان رزولوشن کروماتوگرام نمونه تأثیر می گذارد. دما نیز به عنوان یکی از پارامترها در توسعه روش ها استفاده می شود. محفظه ستونی می تواند یک کوره یا آون ستونی ساده باشد که محیط اطراف ستون را تا دمای از پیش تعیین شده (معمولاً تا 80 درجه سانتی گراد) گرم می کند. محفظه های ستون مدرن دارای مبدل های حرارتی حلال هستند که حلال را تا دمای از پیش تعیین شده نیز گرم می کنند.

 برای توسعه روش، از ترموستات های ستونی مبتنی بر Peltier ( خنک کننده های ترموالکتریک ، یک قطعه الکترونیکی مبتنی بر نیمه هادی استفاده می کنند( استفاده می شود زیرا این دستگاه ها می توانند دما را با سرعت بیشتری تغییر دهند ترموستات های ستونی نه تنها می توانند حلال و محیط یک ستون را گرم کنند، بلکه ستون را خنک می کنند.

در سیستم های UHPLC از دماهای بالاتر برای کاهش ویسکوزیته حلال و کاهش فشار برگشتی استفاده می شود که ناشی از ذرات کوچک و نرخ جریان بالاایجاد میشود. از این رو، محفظه های ستون مورد استفاده برای UHPLC اغلب می توانند تا 100 درجه سانتیگراد یا بالاترگرم شوند.

اصول انتخاب ستون

ستون‌های کروماتوگرافی مایع از استوانه‌هایی از فولاد ضد زنگ یا پلیمرها ساخته می‌شوند یا به ندرت، شیشه، حاوی ذرات سیلیس پیوند خورده یا پلیمر و در ابعاد مختلفی متناسب با نیاز موجود هستند. آنها در ابعاد مختلف برای مطابقت با نیازهای مختلف کروماتوگراف ها و کاربردهای آنها در دسترس هستند.

ژل سیلیکا معمولاً به عنوان یک فاز ثابت در فاز نرمال، HPLC استفاده می‌شود و پشتیبان چندین فاز ثابت با پیوند شیمیایی است. سطح سیلیس با گروه‌های سیلانول به شدت قطبی پوشیده شده است که با مولکول‌ها در فاز متحرک غیرقطبی برهمکنش می‌کنند یا به عنوان محل واکنش برای مواد شیمیایی عمل می‌کنند.

پیوند دادن فاز نرمال HPLC با آنالیت هایی که در آب نامحلول هستند. در فاز معکوس سیستم های کروماتوگرافی، ذرات سیلیس از نظر شیمیایی اصلاح شده اند تا غیر قطبی یا آبگریز باشند و فاز متحرک یک مایع قطبی است  و در سیستم های نرمال از ستون های قطبی با حلال های غیرقطبی استفاده می شود.

ستون‌های بیوکروماتوگرافی

ستون‌هایی برای جداسازی ترکیبات بیولوژیکی مانند پروتئین‌ها و پپتیدها، الیگونوکلئوتیدها و پلی نوکلئوتیدها و سایر مولکول‌ها و ویروس ها است.

ستون های زیستی به گونه ای طراحی شده اند که اتصال غیرقابل برگشت یا غیر اختصاصی نمونه به ستون را تا حد زیادی به حداقل برسانند یا از بین ببرند و عملکرد بیولوژیکی (فعالیت آنزیمی) را حفظ کنند. اغلب، بیو ستون ها به گونه ای ساخته می شوند که فلزات فعال با نمونه تماس نگیرند.

آنها ممکن است با پلیمرها (به عنوان مثال PEEK  ) سیلیس ذوب شده و فولاد ضد زنگ با روکش شیشه ای یا اجزای فلزی که برای رندر کردن ستون روکش شده اند ساخته شوند. در جدول زیر کاربرد  انواع ستون ها با نوع و اندازه ذرات فاز ساکن آورده شده است.

کار با گرادیانت

هرچه نمونه شما پیچیده تر باشد، احتمال بیشتری وجود دارد که از روش گرادیان استفاده کنید. جداسازی  فاز گرادیانت برای ترکیباتی که از نظر قطبیت بسیار متفاوت هستند یا وزن مولکولی بالایی دارند، مانند پپتیدها و پروتئین ها کاربردی است.

 در شکل زیر کروماتوگرام مخلوط علف کش هشت جزئی است که با دو روش گرادیانت و ایزوکراتیک مقایسه شده است. هنگامی که به صورت ایزوکراتیک جدا می شود، این مخلوط علف کش هشت جزئی به طور کامل در 70 دقیقه حل نمی شود و اجزای 1 و 2 با هم شسته می شوند. با کاهش درصد آلی برای جداسازی پیک‌های 1 و 2 تنها منجر به زمان نگهداری غیرقابل قبول می‌شود. هنگام استفاده از گرادیان 20 تا 60 درصد، هر هشت جزء به خوبی در کمتر از 30 دقیقه تفکیک می‌شوند.

کاربا گرادیانت