کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله تکنیک‌های جداسازی (Separation) مرسوم در بسیاری از علوم است. در این مقاله ابتدا به تاریخچه‌ای از کروماتوگرافی، اصطلاحات و روابط آن اشاره می‌شود و در ادامه به نحوه انتخاب دقیق پارامترهای دستگاهی وآزمایشگاهی به منظور انجام یک جداسازی کارآمد اشاره می‌شود. پارامترهایی از قبیل انتخاب نوع ستون و انتخاب فاز متحرک که به قطبیت آنالیت بستگی دارد و یا انتخاب آشکارساز مناسب که به ساختار و ویژگی‌های شیمیایی نمونه بستگی دارد؛ و در نهایت به نحوه آنالیز کمی و کیفی کروماتوگرام اشاره می‌شود.

مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی

درتمامی روش‌های کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام می‌شود. این تفاوت مقدار، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی می‌گردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان می‌کنند. در این رابطه C_m و C_s به ترتیب نشان‌دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا 

از میان تکنیک‌های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیون‌ها دلار صرف خرید و فروش دستگاه‌های HPLC در دنیا می‌شود. علت این رشد را می‌توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه‌های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیک GC (کروماتوگرافی گازی) امکان‌پذیر نیستند، نسبت داد.

فاز ساکن و فاز متحرک 

در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌‌شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن < اترها < استرها < کتون‌ها < آلدئیدها < آمیدها < آمین‌ها < الکل‌ها

خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:

• درصد خلوص بالا (حلال‌هایی با درصد خلوص بسیار بالا، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد)
• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون (به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می‌شود)
• واکنش‌پذیری کم (Inertness)
  • قابلیت تطابق با آشکارساز

 اجزاء و قسمت‌های مختلف دستگاه HPLC

دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت‌های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود:

۱- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌های شستشودهنده ستون ریخته شده است.

۲- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می‌گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیت‌ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیک‌ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می‌شود که در ستون‌هایی با قطر مرسوم (کمتر از ۵mm)، سرعت جریان نباید بالاتر از ۲/۵ ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می‌شود.

به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال‌ها در ازای یک حلال خالص می‌تواند به‌کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می‌شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته می‌شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه‌ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می‌یابد.

۳- تزریق‌کننده (Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ‌هایی با ظرفیت‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه‌بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد ۵ تا ۵۰۰ میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.

۴- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column) می‌شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی‌متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده‌ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمی‌کند. طول ستون‌های اصلی دستگاه معمولا حدود ۳۰-۱۰ سانتی‌متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته‌دار و یا متخلخل است، پر کرده‌اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد ۳ تا ۵ میکرومتر است.

ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم‌ترین ستون‌های غیرقطبی می‌توان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector) هدایت می‌شوند.

در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می‌کنیم. برای مثال در ستون‌های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو می‌دهند.

۵- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:
> حساسیت بالا
> غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی، نمونه را تخریب نکند.
> پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)

درادامه به تعدادی ازآشکارسازهای مرسوم اشاره می‌شود:

الف– از پرکاربردترین انواع آشکارساز، طیف‌سنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت نمونه اندازه‌‌گیری می‌شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می‌شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می‌بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم‌های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.

ب– آشکارساز ضریب شکست: اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می‌شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت ازآن استفاده می‌شود.

ج– آشکارساز فلورسانس، حساس‌تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند؛ درنتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.

د– آشکارساز الکتروشیمیایی، که عملکرد آن برپایه واکنش‌های اکسید و احیا می‌باشد و شامل روش‌های آمپرومتری (Amperometry)، پلاروگرافی (Polarography)، کلون‌سنجی (Coulometry) و هدایت‌سنجی (Conductometry) است.

ه– آشکارساز طیف‌سنج جرمی (MS): این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می‌گیرد. از این جمله می‌توان به حد تشخیص (LOD) بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری (Selectivity) بالا، و امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم‌های شیمیایی اشاره کرد.

در صورتیکه از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق‌سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می‌شود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است.

کاربردهای کیفی:

آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می‌شود. از آنجایی‌که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص می‌باشد، می‌توان از آن جهت تعیین نوع آنالیت استفاده کرد. به این منظور کروماتوگرام آنالیت را با کروماتوگرام به‌دست آمده از استاندارد آن آنالیت مقایسه می‌کنند. در صورت یکسان بودن زمان بازداری می‌توان با قطعیت نوع ماده را تعیین کرد. ذکر این نکته لازم است که این مقایسه این دو کروماتوگرام تنها در شرایط آزمایشگاهی و دستگاهی کاملاً یکسان معتبر است.

آنالیز کمی:

به‌منظور تعیین کمی مقدار آنالیت، سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول را با نمونه استاندارد مقایسه می‌کنند. در مواردی که پیک‌ها باریک و متقارن باشند، اندازه‌گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است. هر چند که امروزه به‌راحتی می‌توان ارتفاع و سطح زیر پیک را به کمک دستگاه‌های الکترونیک با دقت و صحت بالایی محاسبه کرد. روش‌های مختلفی جهت محاسبه مقدار مجهول وجود دارد که در ادامه به برخی از این روش‌ها اشاره می‌شود:

روش استاندارد خارجی (External Standard): 

در این روش، محلول‌هایی با غلظت‌های مختلف از استاندارد (استاندارد آنالیت مورد نظر) ساخته شده و سپس بر اساس ارتفاع یا سطح زیر پیک بدست آمده از کروماتوگرام این استانداردها، منحنی کالیبراسیون (منحنی ارتفاع و یا سطح زیر پیک، بر حسب غلظت) رسم می‌شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده، مقدار ارتفاع و یا سطح زیر پیک نمونه مجهول، مقدار دقیق آنالیت محاسبه می‌شود.

روش افزایش استاندارد (Standard Addition): 

در این روش ابتدا ماده مجهول، آنالیز می‌شود، سپس به چند ظرف که حاوی مقدار یکسانی از نمونه است، حجم‌های مشخصی از استاندارد اضافه می‌شود و کروماتوگرام مربوط به هر مرحله را آنالیز و در نهایت ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه‌ها را بر اساس حجم استاندارد اضافه شده رسم می‌کنند. در نهایت با استفاده از روابط موجود می‌توان غلظت نمونه را محاسبه کرد. استفاده از این روش سبب حفظ بافت و ماتریس نمونه‌ها می‌شود، در نتیجه با این روش احتمال مزاحمت بافت (Matrix Interference) نمونه از بین برده می‌شود.

استاندارد داخلی (Internal Standard): 

دو نوع خطا (سیستماتیک و تصادفی) در سیستم موجود است. برخی از این منابع ثابت را می‌توان با اضافه کردن یک استاندارد داخلی به نمونه‌ها و تقسیم ارتفاع پیک یا سطح زیر پیک مربوط به هر آنالیت بر همین مقادیر مربوط به استاندارد داخلی، حذف کرد. در انتخاب استاندارد داخلی باید به شباهت‌های ساختاری آنالیت با جزء انتخابی، نزدیک بودن زمان بازداری پیک آن به پیک نمونه و …، توجه کرد. با انتخاب یک استاندارد داخلی مناسب می‌توان خطا را از ۱ تا ۲ درصد به ۵٫۰ تا ۱ درصد کاهش داد.

نتیجه گیری:

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه‌گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روش‌های دیگر و آشکارسازهای پیشرفته‌ای مانند طیف‌‍سنج جرمی کاربردهای زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.