روش‌های کروماتوگرافی بر پایه دو مفهوم کلی دسته‌بندی می‌شوند: در روش اول، جداسازی بر اساس مفاهیم فیزیکی صورت گرفته و شامل دو گروه کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است.

اساس نام‌گذاری در دسته‌بندی دوم که مرسوم‌‌تر است، نوع فاز متحرک، فاز ساکن و همچنین نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است. این دسته شامل دو گروه کلی کروماتوگرافی مایع (فاز متحرک، مایع می‌باشد) و کروماتوگرافی گازی (با فاز متحرک گاز) است.

درتمامی روش‌های کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام می‌شود. این تفاوت مقدار، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی می‌گردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان می‌کنند. در این رابطه C_m و C_s به ترتیب نشان‌دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.

نتایج تحقیقات نشان می‌دهند که پدیده‌های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی بر روی سرعت جداسازی و همچنین پهنای باند دیده شده برای هر آنالیت تاثیر دارند. از بین تئوری‌های موجود که به توجیه و محاسبه این عوامل می‌پردازند، تئوری بشقابک‌های فرضی (Plates) کاربرد بیشتری دارد. در این تئوری فرض می‌شود که هرستون از یک سری لایه‌های باریک، افقی و کاملا مجزا از هم، که به طور متوالی قرار گرفته‌اند، تشکیل شده است. به هر یک از این لایه‌ها، بشقابک گفته می‌شود. در هر کدام از این بشقابک‌ها، آنالیت در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد و در نهایت با انتقال بین بشقابک‌ها عمل جداسازی صورت می‌پذیرد. کارایی هر ستون به تعداد بشقابک‌های موجود درستون و یا به عبارت دیگر، به تعداد تعادل‌های ایجاد شده در ستون بستگی دارد. بنابراین برای بررسی کارایی ستون، تعداد بشقابک‌های فرض (N) را از رابطه زیرمحاسبه می‌کنند. در این رابطه H نشان‌دهنده ارتفاع هر بشقابک و L طول ستون را به نمایش می‌گذارد.

در این مباحث پارامترها و تعاریف مختلف دیگری به منظور محاسبه کارایی، شرایط آزمایشگاهی و در نهایت اندازه‌گیری کمی آنالیت وجود دارند. برای اطلاعات بیشتر به منبع شماره ۱ مراجعه شود.

از میان تکنیک‌های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیون‌ها دلار صرف خرید و فروش دستگاه‌های HPLC در دنیا می‌شود. علت این رشد را می‌توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه‌های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیک GC (کروماتوگرافی گازی) امکان‌پذیر نیستند، نسبت داد.

در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌‌شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه‌های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:

• درصد خلوص بالا (حلال‌هایی با درصد خلوص بسیار بالا، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد)

• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون (به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می‌شود)

دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت‌های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود:

۲- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می‌گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیت‌ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیک‌ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می‌شود که در ستون‌هایی با قطر مرسوم (کمتر از ۵mm)، سرعت جریان نباید بالاتر از ۲/۵ ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می‌شود.

به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال‌ها در ازای یک حلال خالص می‌تواند به‌کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می‌شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته می‌شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه‌ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می‌یابد.

۳- تزریق‌کننده (Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ‌هایی با ظرفیت‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه‌بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد ۵ تا ۵۰۰ میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.

۴- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column) می‌شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی‌متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده‌ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمی‌کند. طول ستون‌های اصلی دستگاه معمولا حدود ۳۰-۱۰ سانتی‌متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته‌دار و یا متخلخل است، پر کرده‌اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد ۳ تا ۵ میکرومتر است.

ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم‌ترین ستون‌های غیرقطبی می‌توان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector) هدایت می‌شوند.

در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می‌کنیم. برای مثال در ستون‌های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو می‌دهند.

۵- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:

الف- از پرکاربردترین انواع آشکارساز، طیف‌سنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت نمونه اندازه‌‌گیری می‌شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می‌شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می‌بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم‌های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.

ب- آشکارساز ضریب شکست: اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می‌شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت ازآن استفاده می‌شود.

ج- آشکارساز فلورسانس، حساس‌تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند؛ درنتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.

د- آشکارساز الکتروشیمیایی، که عملکرد آن برپایه واکنش‌های اکسید و احیا می‌باشد و شامل روش‌های آمپرومتری (Amperometry)، پلاروگرافی (Polarography)، کلون‌سنجی (Coulometry) و هدایت‌سنجی (Conductometry) است.

ه- آشکارساز طیف‌سنج جرمی (MS): این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می‌گیرد. از این جمله می‌توان به حد تشخیص (LOD) بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری (Selectivity) بالا، و امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم‌های شیمیایی اشاره کرد.

در صورتیکه از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق‌سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می‌شود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است.

۴- اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام