سیستم کروماتوگرافی مایع

یک سیستم کروماتوگرافی مایع برای جداسازی مخلوطی از آنالیت ها و شناسایی ترکیبات مجزا از چهار جزء اصلی تشکیل شده است. هر جزء یا ماژول در یک سیستم LC دارای یک عملکرد خاص و به همان اندازه مهم است. فرآیندهای جداسازی و شناسایی برای توضیح این ماژول ها، مسیر جریان را از ورود نمونه به دستگاه در این مقاله از آراتجهیز دنبال می کنیم.

عملکرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

• ماژول گاز زدا (Degasser)

بسیاری از دستگاه های گروماتوگرافی دارای یک واحد گاز زدایی برای حذف هوای داخل حلال ها یا فاز متحرک هستند. وجود حباب های هوا در فاز متحرک باعث اختلال در کارکرد صحیح پمپ خواهد بود در واقع استفاده از گاز زدا برای حلال ها به کاهش نوسانات پس زمینه یا Baseline آشکارساز کمک می کند.

• ماژول پمپ (Pump) قلب یک سیستم کروماتوگرافی مایع

قبل از تحویل فاز متحرک به سیستم، پمپ حلال ها را به نسبت ثابت مخلوط می کند. حال این اختلاط می تواند بصورت نسبت ثابت حلال ها باشد (ایزوکراتیک) یا به نسبت متفاوت (گرادیان)

محدوده فشار پمپ

پمپ های HPLC و UHPLC برای فرایند جداسازی، نمونه موردنظر را به همراه فاز متحرک از طریق ستون که شامل فاز ساکن است، منتقل می کند. جهت خرید دستگاه HPLC می توانید با مشاورین واحد فروش شرکت آراتجهیز فارمد در ارتباط باشید.

پمپ باید فاز متحرک را در فشارهای بالا بین 50 تا 1300 بار تحویل دهد تا بر مقاومت فاز ساکن در ستون غلبه کند. ستون های HPLC استاندارد معمولا حاوی ذرات 5 میکرومتری مبتنی بر سیلیس هستند.

پمپ هایی که قادر به تامین جریان در فشارهای تا 400 بار هستند معمولا برای استفاده با ستون های HPLC استاندارد بین 50 تا 300 میلی متر طول و با قطر داخلی 4.6 میلی متر کافی می باشد.

در مقابل در سیستم UHPLC مدرن ستون های بلند (مثلا 300 میلی متر) با ذرات ریز و کاملا متخلخل (کمتر از 2 میکرومترو قطرهای داخلی کوچک (کمتر از 2.1 میلی متر) به پمپ هایی نیاز دارند که بتوانند فشارهای 1000 بار یا بالاتر را تحمل کنند. نرخ جریان یا فلوی جریان Hplc بین 100 – 10 میلی لیتر در دقیقه است.

پمپ ها در کروماتوگرافی براساس نوع اختلاط حلال ها، تعداد حلال و توان فشار برگشتی به سه گروه تقسیم می شود.

• پمپ باینری- Binary
• پمپ کواتنرنری- Quaternary
• پمپ ایزوکراتیک- Isocratic

اختلاط حلال

علاوه بر تحویل فاز متحرک، پمپ باید حلال ها را با دقت بالا و نسبت مشخص شده مخلوط کند. پمپ باید یک نسبت دقیق و ثابت از حلال برای شستشوی ایزوکراتیک و همچنین گرادیان که در آن نسبت دو یا چند حلال در طول زمان تغییر می کند. توانایی مخلوط کردن حلال ها به طور دقیق و تامین فلوی جریان تکرارپذیر و بدون نوسان از ویزگی های اصلی یک پمپ خوب می باشد. زمان ماندگاری یکی از پارامترهای اساسی در کروماتوگرافی مایع و نشان دهنده مدت زمان ماندگاری جز جدا شده از ترکیب در فاز ساکن می باشد.

پمپ های باینری

پمپ های باینری شامل دو پمپ جداگانه می باشد و فشارهای بالاتری را میتوانند تحمل کنند و معمولاً قادرند فقط دو حلال را مخلوط کنند و مجهز به دو کانال حلال به سمت محفظه ی اختلاط حلال یا mixing chamber  می باشد.

مزیت اصلی پمپ های باینری این است که اختلاط حلال در زمان بسیار دقیق انجام میگیرد و مخلوط کردن نسبت های کوچک از یکی از حلال ها  از مزیت های بزرگ این پمپ ها می باشد. این پمپ ها اختلاط حلال بسیار دقیقی می دهد.

یکی دیگر از مزایای این نوع پمپ ها تحمل فشار برگشتی بالاتری نسبت به پمپ های کواترنری است و اختلاط حلال در پمپ باینری حجم تاخیر کمتری را دربر میگیرد.

پمپ های کواترنری

این پمپ ها از یک پمپ تشکیل شده اند و توانایی اختلاط چهار نوع حلال را دارد. در واقع به چهار کانال برای ورود حلال به محفظه اختلاط حلال ها یا mixing chamber مجهز است. حلال ها را با فشار کمتری مخلوط می کنند.

• ترموستات ستونی در کروماتوگرافی مایع HPLC – ماهیچه هایی برای تولید گرما

ترموستات ستونی یک جزئی اغلب دست کم گرفته شده در یک سیستم کروماتوگرافی مایع است. این ماژول بسیار مهم است اهمیت تضمین یک محیط پایدار برای ستون جداسازی و دستیابی به نتایج قابل تکرار برای زمانی که دمای محیط در آزمایشگاه در طول مدت تغییر می کند، محیط پایدار از اهمیت ویژه ای برخوردار است.

دما بر Retention Factor و بر میزان رزولوشن کروماتوگرام نمونه تأثیر می گذارد. دما نیز به عنوان یکی از پارامترها در توسعه روش ها استفاده می شود. محفظه ستونی می تواند یک کوره یا آون ستونی ساده باشد که محیط اطراف ستون را تا دمای از پیش تعیین شده (معمولا تا 80 درجه سانتی گراد) گرم می کند. محفظه های ستون مدرن دارای مبدل های حرارتی حلال هستند که حلال را تا دمای از پیش تعیین شده نیز گرم می کنند.

برای توسعه روش، از ترموستات های ستونی مبتنی بر Peltier (خنک کننده های ترموالکتریک، یک قطعه الکترونیکی مبتنی بر نیمه هادی استفاده می کنند) استفاده می شود زیرا این دستگاه ها می توانند دما را با سرعت بیشتری تغییر دهند ترموستات های ستونی نه تنها می توانند حلال و محیط یک ستون را گرم کنند، بلکه ستون را خنک می کنند.

در سیستم های UHPLC از دماهای بالاتر برای کاهش ویسکوزیته حلال و کاهش فشار برگشتی استفاده می شود که ناشی از ذرات کوچک و نرخ جریان بالا ایجاد می شود. از این رو، محفظه های ستون مورد استفاده برای UHPLC اغلب می توانند تا 100 درجه سانتی گراد یا بالاتر گرم شوند.

اصول انتخاب ستون‌ های کروماتوگرافی مایع

ستون‌ های کروماتوگرافی مایع از استوانه‌ هایی از جنس فولاد ضد زنگ یا پلیمرها ساخته می‌ شوند یا به ندرت، شیشه، حاوی ذرات سیلیس پیوند خورده یا پلیمر و در ابعاد مختلفی متناسب با نیاز موجود هستند. آنها در ابعاد مختلف برای مطابقت با نیازهای مختلف کروماتوگراف ها و کاربردهای آن ها در دسترس هستند.

ژل سیلیکا معمولا به عنوان یک فاز ثابت در فاز نرمال، HPLC استفاده می‌ شود و پشتیبان چندین فاز ثابت با پیوند شیمیایی است. سطح سیلیس با گروه‌ های سیلانول به شدت قطبی پوشیده شده است که با مولکول‌ها در فاز متحرک غیرقطبی برهمکنش می‌کنند یا به عنوان محل واکنش برای مواد شیمیایی عمل می‌کنند.

پیوند دادن فاز نرمال HPLC با آنالیت هایی که در آب نامحلول هستند. در فاز معکوس سیستم های کروماتوگرافی، ذرات سیلیس از نظر شیمیایی اصلاح شده اند تا غیر قطبی یا آبگریز باشند و فاز متحرک یک مایع قطبی است و در سیستم های نرمال از ستون های قطبی با حلال های غیرقطبی استفاده می شوند.

ستون‌ های بیوکروماتوگرافی

ستون‌ هایی برای جداسازی ترکیبات بیولوژیکی مانند پروتئین‌ ها و پپتیدها، الیگونوکلئوتیدها و پلی نوکلئوتیدها و سایر مولکول‌ ها و ویروس ها است.

ستون های زیستی به گونه ای طراحی شده اند که اتصال غیرقابل برگشت یا غیر اختصاصی نمونه به ستون را تا حد زیادی به حداقل برسانند یا از بین ببرند و عملکرد بیولوژیکی (فعالیت آنزیمی) را حفظ کنند. اغلب، بیوستون ها به گونه ای ساخته می شوند که فلزات فعال با نمونه تماس نگیرند.

آنها ممکن است با پلیمرها (به عنوان مثال PEEK) سیلیس ذوب شده و فولاد ضد زنگ با روکش شیشه ای یا اجزای فلزی که برای رندر کردن ستون روکش شده اند ساخته شوند.

در جدول زیر کاربرد انواع ستون ها با نوع و اندازه ذرات فاز ساکن آورده شده است.

کار با گرادیانت چگونه است؟

هرچه نمونه شما پیچیده تر باشد، احتمال بیشتری وجود دارد که از روش گرادیان استفاده کنید.

جداسازی فاز گرادیانت برای ترکیباتی که از نظر قطبیت بسیار متفاوت هستند یا وزن مولکولی بالایی دارند، مانند پپتیدها و پروتئین ها کاربردی است.

در شکل زیر کروماتوگرام مخلوط علف کش هشت جزئی است که با دو روش گرادیانت و ایزوکراتیک مقایسه شده است. هنگامی که به صورت ایزوکراتیک جدا می شود، این مخلوط علف کش هشت جزئی به طور کامل در 70 دقیقه حل نمی شود و اجزای 1 و 2 باهم شسته می شوند. با کاهش درصد آلی برای جداسازی پیک‌ های 1 و 2 تنها منجربه زمان نگهداری غیرقابل قبول می‌ شود. هنگام استفاده از گرادیان 20 تا 60 درصد، هر هشت جزء به خوبی در کمتر از 30 دقیقه تفکیک می‌ شوند.

کاربا گرادیانت