دستگاه کاپیلاری الکتروفورز CE
الکتروفورز مویین (انگلیسی: Capillary Electrophoresis) یک روش جداسازی الکتروسینتیکی است که در لوله های مویین با قطر زیر یک میلی متر اعمال می شود. در این روش، مهاجرت اجزای نمونه با سرعت های متغیر در اثر میدان الکتریکی بکار رفته در یک لوله مویین با قطر کوچک و از جنس سیلیس که با پلی آمید پوشش داده شده است، صورت می گیرد.
برای آشکارسازی اجزای نمونه از آنالیز فلورسنس یا طیف سنجی بوسیله دریچه ای در لوله مویین استفاده می گردد. الکتروفورز مویین در شناسایی توالی DNA، فراکافت پروتیین ها، پپتیدها، ترکیبات کایرال، داروها، یون های معدنی، خودسامانی، شناسایی و جداسازی نانومواد و آنالیزهای جنایی کاربرد دارد.
اساس عملکرد این دستگاه بر پایه رفتار حرکت ذرات در داخل لوله مویین با اعمال ولتاژهای بالا است. اجزای تشکیل دهنده ترکیبات و مواد در یک لوله مویین که از یک بافر پر شده است با اعمال ولتاژ بالا در حدود ۵ تا ۳۰ کیلوولت حرکت می کنند. این مواد در زمان های مختلف از مقابل یک آشکارساز نوری عبور می کنند. هر ذره با مشخصات خاص از میان لوله مویینه عبور می کند و یک آشکارساز فرابنفش در انتهای مسیر مدت زمان حرکت یون، مولکول، درشت مولکول، نانوذره یا میکروارگانیسم را ثبت خواهد کرد.
CE اوج دقت و سرعت در جداسازی مولکولی
در دنیای تکنیک های جداسازی، الکتروفورز مویرگی (Capillary Electrophoresis) یا به اختصار CE، به عنوان یکی از قدرتمندترین و کارآمدترین روش ها برای آنالیز مخلوط های پیچیده مولکولی شناخته می شود.
این تکنیک را می توان نسخه ای فوق پیشرفته، مینیاتوری و تمام خودکار از الکتروفورز ژل سنتی دانست که در آن، جداسازی به جای یک ژل صفحه ای، در داخل یک لوله شیشه ای بسیار باریک به نام مویرگ (Capillary) انجام می شود.
الکتروفورز مویرگی به دلیل سرعت بسیار بالا، قدرت تفکیک فوق العاده و نیاز به مقادیر ناچیز از نمونه و حلال، به ابزاری حیاتی در صنایع داروسازی، بیوتکنولوژی و آنالیزهای بالینی و محیطی تبدیل شده است.
اصول عملکرد دستگاه کاپیلاری الکتروفورز
اساس کار الکتروفورز مویرگی، جداسازی مولکول های باردار بر اساس سرعت حرکت متفاوت آن ها در یک میدان الکتریکی قوی است. اما نکته منحصربه فرد و کلیدی در این تکنیک، پدیده ای به نام جریان الکترواسموتیک (Electroosmotic Flow) یا به اختصار EOF است که درک آن برای فهم عملکرد CE ضروری است.
یک لوله مویرگی بسیار نازک (که معمولا از جنس سیلیس ذوب شده ساخته شده) با یک محلول بافری پر می شود. دیواره داخلی این مویرگ سیلیسی در تماس با بافر، دارای بار الکتریکی منفی می شود.
-
ایجاد رودخانه الکتریکی (EOF)
هنگامی که یک ولتاژ بسیار بالا (تا ۳۰ هزار ولت) در طول مویرگ اعمال می شود، یون های مثبت موجود در بافر به سمت دیواره منفی مویرگ جذب می شوند. این یون های مثبت متحرک، کل محلول بافر را با خود به سمت الکترود منفی (کاتد) می کشانند. این حرکت توده ای و یکنواخت بافر در طول مویرگ، مانند یک “رودخانه” قوی و سریع عمل می کند که به آن جریان الکترواسموتیک یا EOF می گویند.
حال نمونه که حاوی مولکول های مختلف است به ابتدای مویرگ تزریق می شود. سرعت نهایی حرکت هر مولکول در داخل مویرگ، حاصل جمع سرعت حرکت ذاتی خود آن مولکول (که به بار و اندازه اش بستگی دارد) و سرعت “رودخانه” EOF است.
-
- یون های مثبت (کاتیون ها): سریع ترین حرکت را دارند، زیرا حرکت ذاتی آن ها به سمت کاتد با جهت حرکت EOF همسو است.
- مولکول های خنثی: بار الکتریکی ندارند و حرکت ذاتی هم ندارند، بنابراین صرفا با سرعت EOF حمل می شوند.
- یون های منفی (آنیون ها): حرکت ذاتی آن ها در خلاف جهت EOF (به سمت الکترود مثبت یا آند) است. اما در اکثر موارد، قدرت “رودخانه” EOF آنقدر زیاد است که بر حرکت ذاتی آنیون ها غلبه کرده و آن ها را نیز به سمت کاتد و دتکتور می برد، البته با سرعتی بسیار کمتر از مولکول های خنثی و مثبت
در نتیجه، مولکول ها به ترتیب به صورت کاتیون ها، سپس خنثی ها، و در آخر آنیون ها از ستون خارج شده و به آشکارساز یا دتکتور می رسند و بدین ترتیب جداسازی کامل می شوند.
اجزای اصلی یک سیستم الکتروفورز مویرگی
۱. منبع تغذیه ولتاژ بالا (High-Voltage Power Supply)
برای تولید میدان الکتریکی قوی و پایدار که نیروی محرکه جداسازی است.
۲. مویرگ (Capillary)
لوله نازکی از جنس سیلیس ذوب شده با قطر داخلی بسیار کم (معمولا ۲۵ تا ۷۵ میکرومتر) و طول ۳۰ تا ۱۰۰ سانتی متر. این مویرگ اغلب درون یک کارتریج برای سهولت استفاده و کنترل دقیق دما قرار دارد.
۳. ظروف بافر (Buffer Vials)
دو ظرف کوچک حاوی محلول بافر که ابتدا و انتهای مویرگ در آن ها قرار می گیرد.
۴. سیستم تزریق نمونه (Injection System)
برای وارد کردن حجم بسیار کوچکی از نمونه (در حد چند نانولیتر) به داخل مویرگ. تزریق می تواند به روش هیدرودینامیکی (با اعمال فشار) یا الکتروکینتیکی (با اعمال ولتاژ برای مدت کوتاه) انجام شود.
۵. آشکارساز یا دتکتور (Detector)
معمولا در نزدیکی انتهای خروجی مویرگ نصب شده و مولکول ها را حین عبور شناسایی می کند. رایج ترین نوع، دتکتور جذب فرابنفش-مرئی (UV-Vis Absorbance) است که به صورت یک پنجره شفاف بر روی خود مویرگ تعبیه شده است. دتکتورهای فلورسانس (برای حساسیت بالاتر)، هدایت سنجی و طیف سنجی جرمی در سیستم های CE-MS نیز استفاده می شوند.
۶. نمونه بردار خودکار (Autosampler)
برای مدیریت و تزریق خودکار نمونه ها از تعداد زیادی ویال، که برای آزمایشگاه های با حجم کاری بالا ضروری است.
۷. کامپیوتر و نرم افزار
برای کنترل کل سیستم، تنظیم پارامترهای آزمایش، جمع آوری داده ها و تحلیل نتایج که به صورت الکتروفروگرام نمایش داده می شود.
حالت های مختلف و تطبیق پذیری دستگاه CE
الکتروفورز مویرگی یک تکنیک بسیار انعطاف پذیر است و حالت های مختلفی دارد که هر یک برای کاربرد خاصی بهینه شده اند:
-
الکتروفورز ناحیه ای مویرگی (CZE)
ساده ترین و رایج ترین حالت که در ابتدای مقاله توضیح داده شد و برای جداسازی یون های کوچک و بزرگ به کار می رود.
-
کروماتوگرافی الکتروکینتیکی میسلی (MEKC)
برای جداسازی مولکول های خنثی به کار می رود. در این روش، سورفکتانت هایی به بافر اضافه می شود که ساختارهایی به نام میسل تشکیل می دهند. مولکول های خنثی بر اساس میزان برهمکنش خود با این میسل ها از یکدیگر جدا می شوند.
-
الکتروفورز ژل مویرگی (CGE)
در این حالت، مویرگ با یک ماتریس ژلی (مانند پلی آکریل آمید) پر می شود. این ژل مانند یک الک مولکولی عمل کرده و برای جداسازی ماکرومولکول ها مانند DNA ،RNA و پروتئینها بر اساس اندازه به کار می رود. این روش در توالی یابی DNA و آنالیز قطعات DNA کاربرد فراوان دارد.
کاربردهای گسترده الکتروفورز مویرگی
کنترل خلوص داروها، جداسازی ایزومرهای کایرال (مولکول هایی که مانند دست چپ و راست، تصویر آینه ای یکدیگرند)، آنالیز یون های معدنی و آلی، آنالیز پروتئین های دارویی
توالی یابی DNA (یکی از ارکان اصلی پروژه ژنوم انسان)، آنالیز قطعات DNA (مانند کاربردهای پزشکی قانونی)، آنالیز خلوص و پایداری RNA و پروتئین ها
آنالیز اسیدهای آلی، ویتامین ها، آمینواسیدها، شیرین کننده های مصنوعی و سایر افزودنی ها
بررسی پروتئین های سرم خون، آنالیز متابولیت ها در ادرار و تشخیص نشانگرهای زیستی بیماری ها
اندازه گیری کاتیون ها و آنیون های غیرآلی (مانند نیترات و فسفات) و آلاینده های آلی در نمونه های آب
مزایای کلیدی CE
-
کارایی و قدرت تفکیک بسیار بالا
منجربه تولید پیک های بسیار تیز و جداسازی بهتر ترکیبات پیچیده می شود.
اکثر جداسازی ها در کمتر از ۳۰ دقیقه انجام می شوند.
-
مصرف بسیار کم نمونه و حلال
نیاز به تنها چند نانولیتر نمونه و چند میلی لیتر بافر، که هزینه ها را کاهش داده و برای نمونه های کمیاب ایده آل است.
کل فرآیند از تزریق تا تحلیل داده به صورت خودکار انجام می شود.
الکتروفورز مویرگی با ترکیب اصول الکتروفورز و تکنولوژی میکروفلوئیدیک، به یک ابزار تحلیلی قدرتمند، سریع و کارآمد تبدیل شده است. توانایی این تکنیک در جداسازی طیف وسیعی از مولکول ها با وضوح بالا و مصرف کم نمونه، آن را به یک انتخاب ایده آل برای بسیاری از چالش های آنالیزی در دنیای مدرن علم و صنعت مبدل کرده است.