نگاهی دقیق به تشخیص و پژوهش‌ های مولکولی

واکنش زنجیره‌ ای پلیمراز (PCR) از زمان معرفی‌ اش در دهه ۱۹۸۰، به سرعت به ابزاری بنیادین در زیست‌ شناسی مولکولی تبدیل شد. این فناوری، تکثیر هدفمند قطعات DNA را در آزمایشگاه ممکن ساخت. با نیاز روزافزون به سرعت، دقت، و توانایی سنجش کمی، ریل تایم پی سی آر (Real-Time PCR) یا qPCR (Quantitative PCR) توسعه یافت.

این روش، امکان رصد فرآیند تکثیر را به صورت “همزمان” فراهم کرده و قابلیت اندازه‌ گیری دقیق تعداد نسخه‌ های اولیه مولکول هدف را ارائه می‌ دهد، که گامی بزرگ در تشخیص‌ های دقیقتر و پژوهش‌ های کمی است.

ریل تایم PCR در برابر PCR سنتی

تفاوت اصلی ریل تایم PCR با PCR سنتی (End-Point PCR) در نحوه و زمان پایش محصول است. در روش سنتی، محصولات تنها در انتهای واکنش و معمولا پس از الکتروفورز ژل، به صورت کیفی بررسی می‌ شوند. اما در qPCR، با استفاده از رنگ‌ های فلورسنت یا پروب‌ های نشان‌ دار، تجمع محصولات PCR در هر چرخه ردیابی و اندازه‌ گیری می‌ شود. این ویژگی، امکان کمی‌ سازی دقیق مولکول‌ های هدف اولیه را فراهم می‌ کند، نیاز به مراحل پس از PCR را کاهش داده، در زمان صرفه‌ جویی کرده و احتمال آلودگی را کم می‌ کند.

اصول عملکردی ریل تایم PCR

ریل تایم PCR نیز مانند PCR سنتی بر پایه تکرار چرخه‌ های دمایی شامل سه مرحله استوار است:

• واسرشت (Denaturation)

در دمای بالا (۹۴-۹۸°C)، DNA دو رشته‌ ای به دو رشته جدا تبدیل می‌ شود.

• اتصال پرایمر (Annealing)

دما کاهش یافته (۵۰-۶۵°C) و پرایمرها به توالی‌ های مکمل خود برروی رشته‌ های DNA متصل می‌ شوند.

• طویل‌ شدن (Extension)

دما مجددا افزایش یافته (۷۲°C) و آنزیم DNA پلیمراز، رشته جدید DNA را از انتهای پرایمرها سنتز می‌ کند.

وجه تمایز qPCR، بهره‌ گیری از یک سیستم اپتیکی حساس است که سیگنال فلورسنتی تولید شده (متناسب با مقدار محصول PCR) را در هر چرخه شناسایی و ثبت می‌ کند.

تشخیص فلورسنتی در PCR

دو استراتژی اصلی برای تشخیص فلورسنتی در PCR وجود دارد:

۱. رنگ‌ های متصل‌ شونده به DNA دو رشته‌ ای (Intercalating Dyes)

معروف‌ ترین آن SYBR Green I است که به طور غیر اختصاصی به تمام مولکول‌ های DNA دو رشته‌ ای متصل شده و پس از اتصال، شدت فلورسانس آن افزایش می‌ یابد. این روش ساده و کم‌ هزینه است، اما به دلیل اتصال غیراختصاصی، انجام آنالیز منحنی ذوب (Melt Curve Analysis) پس از واکنش برای تأیید اختصاصیت محصول ضروری است.

۲. پروب‌ های نشان‌ دار شده اختصاصی توالی (Sequence-Specific Probes)

این پروب‌ ها اولیگونوکلئوتیدهایی هستند که به طور ویژه به یک توالی خاص در قطعه DNA هدف متصل می‌ شوند و با یک رنگ فلورسنت گزارشگر (Reporter) و یک رنگ خاموش‌ کننده (Quencher) نشان‌ دار شده‌ اند. پرکاربردترین نوع، پروب‌ های TaqMan هستند. در این پروب‌ ها، خاموش‌ کننده مانع تابش گزارشگر می‌ شود. با فعالیت اگزونوکلئازی آنزیم پلیمراز حین طویل‌ شدن، پروب تجزیه شده، گزارشگر از خاموش‌ کننده جدا شده و نور فلورسنت ساطع می‌ شود. این روش دقت و اختصاصیت بالاتری دارد و امکان واکنش‌ های Multiplex (تشخیص همزمان چند هدف) را فراهم می‌ کند.

تفسیر نتایج: چرخه آستانه (Ct)

داده‌ های ریل تایم PCR به صورت منحنی‌ های تکثیر (Amplification Plots) نمایش داده می‌ شوند که شدت فلورسانس را بر حسب شماره چرخه نشان می‌ دهند.

پارامتر کلیدی، چرخه آستانه (Threshold Cycle یا Ct) است. Ct، شماره چرخه‌ ای است که در آن، شدت فلورسانس از یک حد آستانه (بالاتر از نویز پس‌ زمینه) عبور کرده و واکنش وارد فاز رشد نمایی می‌ شود. مقدار Ct با لگاریتم تعداد نسخه‌ های اولیه DNA الگو، نسبت معکوس دارد؛ یعنی DNA اولیه بیشتر، Ct کمتر.

با استفاده از منحنی استاندارد (Standard Curve) (تهیه شده از رقت‌ های مشخص DNA با غلظت معلوم)، می‌ توان مقدار اولیه DNA هدف را در نمونه‌ های مجهول کمی‌ سازی کرد.

اجزای کلیدی یک سیستم ریل تایم PCR

یک دستگاه PCR شامل موارد زیر است:

• بلوک حرارتی (Thermal Cycler Block)

برای انجام دقیق و سریع چرخه‌ های دمایی. برخی مدل‌ ها قابلیت گرادیان دمایی برای بهینه‌ سازی دمای اتصال پرایمرها دارند.

• سیستم اپتیکی (Optical System)

شامل منبع نور (LED، لیزر)، فیلترهای نوری، و سیستم آشکارساز (دوربین CCD یا PMT) برای تحریک و اندازه‌ گیری سیگنال فلورسنت.

• کامپیوتر و نرم‌ افزار تخصصی

برای برنامه‌ ریزی، کنترل دستگاه، جمع‌ آوری داده‌ ها و آنالیز پیشرفته نتایج (تعیین Ct، آنالیز منحنی ذوب و بیان ژن)

کاربردهای گسترده دستگاه ریل تایم PCR

تطبیق‌ پذیری و دقت بالای PCR، آن را در حوزه‌ های مختلفی پرکاربرد کرده است:

• تشخیص و تعیین کمیت پاتوژن‌ ها

شناسایی سریع ویروس‌ ها (مانند SARS-CoV-2)، باکتری‌ ها و قارچ‌ ها

• مطالعات بیان ژن

اندازه‌ گیری تغییرات سطح بیان ژن‌ ها در پاسخ به شرایط مختلف یا بیماری‌ ها

• تشخیص بیماری‌ های ژنتیکی و ژنوتایپینگ

شناسایی جهش‌ ها و تغییرات ژنتیکی

• صنعت داروسازی

در کشف، توسعه و ارزیابی اثربخشی داروها

• ایمنی و کنترل کیفیت مواد غذایی

تشخیص آلاینده‌ های میکروبی و مواد GMO

• علوم قانونی

آنالیز نمونه‌ های بیولوژیکی با مقادیر کم DNA

مزایا و ملاحظات ریل تایم PCR

مزایا:

• کمی‌ سازی دقیق و حساسیت بالا
• سرعت بالا و دامنه دینامیکی وسیع
• کاهش احتمال آلودگی (سیستم بسته)
• قابلیت Multiplexing

ملاحظات:

• هزینه اولیه دستگاه و مواد مصرفی بالاتر از PCR سنتی
• نیاز به طراحی دقیق پرایمر و پروب
• تفسیر نتایج نیازمند دانش و تجربه

انتخاب هوشمندانه دستگاه و خرید از شرکت آراتجهیز فارمد

هنگام انتخاب و خرید دستگاه PCR از شرکت آراتجهیز فارمد ابتدا با کارشناسان فروش در تماس ۰۲۱۸۸۷۶۲۹۴۹ – ۰۲۱۸۸۷۶۳۶۰۴ – ۰۲۱۸۸۴۰۱۷۰۰ باشید، و سپس به عواملی چون تعداد کانال‌ های اپتیکی، سرعت رمپ دمایی، یکنواختی دمایی، قابلیت گرادیان، نرم‌ افزار، حجم نمونه، بودجه و خدمات پس از فروش توجه کنید.

ریل تایم پی سی آر ابزاری قدرتمند و انعطاف‌ پذیر در زیست‌ شناسی مولکولی مدرن است. توانایی آن در ارائه نتایج کمی، سریع و دقیق، افق‌ های جدیدی در تحقیقات، تشخیص‌ های بالینی و کاربردهای صنعتی گشوده است. درک صحیح اصول این تکنیک، کلید استفاده بهینه از پتانسیل آن است.